Tipos de ratones y su cuidado
Los fundadores de la colonia de P. maniculatus bairdii (cepa BW), P. polionotus subgriseus (cepa PO) y P. leucopus (cepa LL) fueron obtenidos originalmente del Centro de Stock Genético de Peromyscus en la Universidad de Carolina del Sur, y luego se establecieron y mantuvieron en la Universidad de Harvard. Los ratones de M. musculus (cepa C57BL/6 J) fueron comprados en el Laboratorio Jackson. Se llevaron a cabo experimentos de comportamiento, FOS y RNAscope en Harvard, y posteriormente, optogenética, quimogenética y grabaciones in vivo se realizaron en el Centro de Neuroelectrónica de Flandes (NERF).
Alojamiento en la Universidad de Harvard
Los ratones fueron alojados en jaulas estándar para roedores (Allentown) con lecho de Bed-o’Cobs de 1/4 de pulgada (The Andersons) en un ciclo de 16 horas de luz y 8 horas de oscuridad, a 23 °C y con una humedad de aproximadamente 20-30%. Se les proporcionó una cabaña de policarbonato rojo, material para anidación Enviro-Dri y un nido de algodón. Todos los ratones tenían acceso ad libitum a alimento irradiado Prolab Isopro RMH 3000 5P74 (LabDiet) y agua.
Alojamiento en el NERF
En NERF, los ratones se alojaron en jaulas ventiladas usando lecho de Lignocel 3-4 (J. Rettenmaier & Söhne) en un ciclo de 12 horas de luz y 12 horas de oscuridad, a 23 °C y con un 50% de humedad (40-60%). A los ratones se les proporcionó material de anidación de algodón. Todos los ratones tenían acceso ad libitum a un alimento (ssniff) y agua.
Uso de animales
Se recopilaron datos de 14 M. musculus y 633 Peromyscus (incluyendo P. maniculatus, P. polionotus y P. leucopus) en una serie de experimentos de comportamiento, electrofisiológicos, moleculares y optogenéticos. En los ensayos de comportamiento con un estímulo de barrido-amenaza, se probaron 14 M. musculus (dos ensayos por ratón), 30 P. maniculatus, 29 P. polionotus y 36 P. leucopus (un ensayo por ratón). Se presentaron estímulos de amenaza repetidos con contrastes variados a 109 P. maniculatus y 116 P. polionotus (dos ensayos cada uno).
Experimentos de comportamiento
Configuración experimental
Para medir la respuesta de comportamiento a un estímulo visual, construimos una arena de comportamiento rectangular de plexiglás de 45 cm de ancho, 30 cm de profundidad y 30 cm de alto. Se fijó una cabaña en forma de prisma triangular en una esquina del piso de la arena. Las paredes y el piso de la arena se cubrieron con un acabado mate para reducir el reflejo. Utilizamos tiras LED infrarrojas para iluminar la arena. Se grabó el comportamiento desde abajo de la arena mediante una cámara sensible al infrarrojo.
Procedimiento experimental
Antes de cada experimento, los ratones se dejaron tranquilos en su jaula durante 24 horas. Todos los experimentos se llevaron a cabo en las primeras 4 horas del período de oscuridad y con luz roja. Se habituó a los ratones en la sala de experimentos durante 30 minutos, y luego se transfirió un ratón al recinto de comportamiento para que se habituara durante 10 minutos.
Análisis de datos
Se utilizó un código personalizado en Matlab para obtener las coordenadas centroids del ratón y el estado del estímulo a partir de las grabaciones en video. Se calculó la velocidad de cada ratón de estas coordenadas y se suavizó con un filtro medio. Se clasificaron los eventos de escape y congelación según los criterios establecidos.
Conclusión
Los experimentos en este estudio se realizaron con el respaldo de los comités de ética animal de Harvard y KU Leuven, asegurando el cumplimiento de la regulación ética en el uso de animales en investigación.
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